一、細胞復蘇和接種
1. 37℃預熱大鼠間充質干細胞培養液（RM-001）和基礎培養液（RM-001B）。
2. 從液氮中取出細胞產品管，快速將其置入37℃水浴中解凍，直到管中只剩下最后一片結晶（注意：不要讓水沒過產品管）。
3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭產品管外壁。
4. 將產品管中的細胞移至15 ml無菌離心管中，慢慢逐滴加入預溫的37℃ 基礎培養液（RM-001B）4-5ml混勻，邊滴加邊搖勻。
5. 用1ml基礎培養液（RM-001B）沖洗產品管，并將其轉移到15 ml離心管中，邊滴加邊搖勻。
6. 輕輕混勻細胞后，取10 μl細胞懸液和10 μl臺盼藍混勻，從中取10 μl計數。 這一步驟非常重要，能確定您收到的產品是否合格（詳見如何計數復蘇的細胞）
7. 細胞懸液在1 000 rpm，室溫條件下，離心5分鐘，去除上清。
8. 加完全培養液4-5ml, 調整細胞量，輕輕混勻細胞，備用。
9. 按5 000-7 500細胞/cm2接種細胞。
10. 每個T25培養瓶中加完全培養液（RM-001）3-5ml， 后置于37℃、5%CO2 培養箱內培養。
二、細胞換液和培養
注意：復蘇或傳代后的細胞，請于24小時后，第一次更換培養液
1. 復蘇后的細胞經37℃、5%CO2 培養箱內培養24小時，此時細胞已完全貼壁，更換培養液后，請繼續在37℃，5％CO2培養箱內培養。
2. 之后，每2-3天更換培養液1次，至細胞長至覆蓋培養面的 80% 可進行傳代或凍存。
3. 換液前，請將培養液從4℃中取出，使其恢復到室溫。
三、消化細胞
1. 消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分別配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，用前按1：1混合。將PBS或D-Hank'S液, 消化液，含10% FBS的基礎培養液回復到室溫。
2. 具體操作如下：
（1） 吸去培養液，加入3 ml PBS或D-Hank'S液，使PBS或D-Hank'S液均勻的分布在培養瓶細胞表面。1分鐘之后，吸去PBS或D-Hank'S液。
（2） 每個T25培養瓶加入消化液 2 ml，使消化液均勻的分布在培養瓶細胞面。
（3） 25℃消化2分鐘，在顯微鏡下看細胞回縮成圓形后，輕輕震動使絕大部細胞脫落。
（4） 向每個培養瓶中加 3-5 ml 含10% FBS的 基礎培養液(RA-001B) 中和胰酶的消化作用。
（5） 用吸管輕輕吹打培養面使細胞完全脫落后，吸至15 ml無菌離心管內。
（6） 20℃，1 500 rpm 離心 5分鐘，棄上清。
（7） 加入一定完全培養液（RM-001)，調整細胞數量后，抽樣加入胎盤藍計數，得到細胞數和活性后，按細胞數傳代或凍存。
四、細胞傳代
1. 消化細胞（詳見第三步）。
2. 按5000-7500個細胞/cm2接種細胞于T25的培養瓶中。
3. 每個培養瓶中加完全培養液（RM-001）3-5ml，后置于37℃、5%CO2 培養箱內培養。
五、細胞凍存
1. 調整細胞數5×105 /ml，加入一定量的基礎培養液（RM-001B)。之后，配制等量的冷凍保護劑。
2. 冷凍保護劑的配制：FBS占80％，DMSO占20％
3. 將細胞懸液于冰浴中，慢慢逐滴加入冷凍保護劑，邊滴加邊搖動，加完后用輕輕吹打混勻。
4. 在冰浴中，將細胞分裝于凍存管中，每管1ml或1.8 ml。
5. 將凍存管置于凍存盒(NALGENE Cat No. 5100-0001)內，放入-80℃冰箱中，24小時后轉入液氮中保存。
